قد يحمل الحمض النووي غير المرغوب فيه في الطيور مفتاح العلاج الجيني الآمن والفعال

وتُظهِر الموافقة الأخيرة على علاج كريسبر-كاس9 لمرض فقر الدم المنجلي أن أدوات تحرير الجينات يمكن أن تؤدي عملاً أفضل في القضاء على الجينات لعلاج مرض وراثي. لكن ليس من الممكن حتى الآن إدخال جينات كاملة في الجينوم البشري لتحل محل الجينات المعيبة أو الضارة.

إن التقنية الجديدة التي تستخدم النقل الرجعي من الطيور لإدخال الجينات في الجينات تحمل وعدًا كبيرًا للعلاج الجيني لأنها تدخل الجينات في “ملاذ آمن” في الجينوم البشري لا يعطل الجينات الأساسية أو يؤدي إلى السرطان.

النواقل الرجعية، أو العناصر الرجعية، عبارة عن قطع من الحمض النووي، والتي عند نسخها إلى الحمض النووي الريبي (RNA)، ترمز للإنزيمات التي تنسخ الحمض النووي الريبي (RNA) مرة أخرى إلى الحمض النووي في الجينوم – وهي دورة ذاتية الخدمة تملأ الجينوم بالحمض النووي الرجعي. يتكون حوالي 40% من الجينوم البشري من هذا الحمض النووي “الأناني” الجديد، على الرغم من أن معظم الجينات معطلة، ويسمى الحمض النووي غير المرغوب فيه.

هناك تقنية جديدة تسمى الإدراج الدقيق بوساطة الحمض النووي الريبي (PRINT)، تستغل قدرة بعض النواقل الرجعية على إدخال جينات كاملة بكفاءة في الجينوم دون التأثير على وظائف الجينات الأخرى. تكمل تقنية PRINT القدرة المعترف بها لتقنية CRISPR-Cas على إسكات الجينات، وإنشاء طفرات نقطية، وإدخال أجزاء قصيرة من الحمض النووي.

تم نشر وصف لـ PRINT، الذي تم تطويره في مختبر كاثلين كولينز، أستاذ علم الأحياء الجزيئي والخلوي في جامعة كاليفورنيا، بيركلي، في 20 فبراير في المجلة. التكنولوجيا الحيوية الطبيعية.

تتضمن الطباعة إدخال حمض نووي جديد في الخلية باستخدام طرق التوصيل المستخدمة لحمل كريسبر-كاس9 إلى الخلايا لتحرير الجينات. للطباعة، يقوم جزء من الحمض النووي الريبي المزود بتشفير بروتين رجعي شائع يسمى بروتين R2، والذي يحتوي على العديد من المكونات النشطة، بما في ذلك نيكاز – وهو إنزيم يربط ويقطع الحمض النووي المزدوج – والرنا المنتسخ العكسي، وهو إنزيم يصنع نسخ الحمض النووي . وقال كولينز إن الحمض النووي الريبوزي (RNA) الآخر عبارة عن قالب لإدخال الحمض النووي المحور (DNA) وشريط الجينات المحورة المستقل تمامًا والذي تقوم العناصر التنظيمية للتعبير الجيني – بروتين R2 – بإدراجه في الجينوم.

الميزة الرئيسية لاستخدام بروتين R2 هو أنه يقوم بإدخال الجين المتحول في منطقة من الجينوم تحتوي على مئات النسخ المتطابقة من نفس الجين – كل منها يشفر الحمض النووي الريبي الريباسي، وهو آلية الحمض النووي الريبي (RNA) التي تحول الرسول RNA (mRNA) إلى بروتين. في حالة وجود نسخ متعددة زائدة عن الحاجة، عندما يؤدي الإدخال إلى تعطيل واحد أو عدد قليل من جينات الحمض النووي الريبي الريباسي، لا يتم تفويت فقدان الجينات.

يؤدي وضع الجينات المحورة في ملاذ آمن إلى تجنب مشكلة كبيرة تتم مواجهتها عند إدخال الجينات المحورة عبر ناقل فيروسي بشري، وهي طريقة شائعة اليوم: غالبًا ما يتم إدخال الجين بشكل عشوائي في الجينوم، مما يؤدي إلى تعطيل الجينات العاملة أو تعطيل تنظيم الجينات أو وظيفتها. ، يمكن أن يؤدي إلى السرطان.

قال كولينز، الذي لديه والتر وروث شوبرت: “يمكن للنهج القائم على كريسبر-كاس9 إصلاح النيوكليوتيدات المتحورة أو إدخال بقع صغيرة من تثبيت تسلسل الحمض النووي. أو تعطيل وظيفة الجينات من خلال طفرات خاصة بالموقع”. كرسي العائلة.

“نحن لا نعطل وظيفة جينية. نحن لا نصحح طفرة جينية داخلية. نحن نتبع نهجًا تكميليًا، وهو وضع جين معبر ذاتيًا في الجينوم ينتج بروتينًا نشطًا. ويتجاوز الجين الوظيفي الناقص “إنها إضافة الجينات المحورة وليس عكس الطفرة. وهو نفسه مثالي لتصحيح أمراض فقدان الوظيفة الناشئة عن طفرات فردية في الجين.”

“الفائزون الحقيقيون يأتون من الطيور”

العديد من الأمراض الوراثية، مثل التليف الكيسي والهيموفيليا، تنتج عن طفرات مختلفة في نفس الجين، وكلها تؤدي إلى تعطيل وظيفة الجين. يجب أن يكون أي علاج لتحرير الجينات يعتمد على تقنية كريسبر-كاس9 مصممًا ليناسب الطفرة المحددة لدى الفرد. يمكن لإعادة التركيب الجيني باستخدام PRINT تسليم الجين الصحيح لكل فرد مصاب بالمرض، مما يسمح لجسم كل مريض بتكوين البروتين الطبيعي بغض النظر عن الطفرة الأصلية.

تستكشف العديد من المختبرات الأكاديمية والشركات الناشئة استخدام الترانسبوزونات والناقلات الرجعية لإدخال الجينات للعلاج الجيني. أحد النواقل الراجعة الشائعة قيد الدراسة من قبل شركات التكنولوجيا الحيوية هو LINE-1 (العنصر 1 المتخلل الطويل)، والذي قام بمضاعفة نفسه وبعض جينات المتنقلين لتغطية 30% من الجينوم في البشر، على الرغم من أن أقل من 100 من النواقل الرجعية LINE-1 الخاصة بجينومنا. النسخ فعالة اليوم، وهي جزء صغير من الجينوم.

كولينز، إلى جانب زملائه في مرحلة ما بعد الدكتوراه في جامعة كاليفورنيا في بيركلي، أكانكشا دافاني وإيفا نوجاليس، أستاذ متميز في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة كاليفورنيا في بيركلي وباحث في معهد هوارد هيوز الطبي. نشرت التركيب المجهري الإلكتروني لبروتين الإنزيم، ديسمبر 2018. 14 مشفر بواسطة عنصر رجعي من السطر 1. طبيعة.

وقال كولينز إن تلك الدراسة أوضحت أن بروتين إعادة النقل LINE-1 سيكون من الصعب هندسته لإدخال جين منقول بأمان وكفاءة في الجينوم البشري. لكن الأبحاث السابقة التي أظهرت أن الجينات التي تم إدخالها في منطقة ترميز الحمض النووي الريبوزي (RNA) المتكررة للجين (rDNA) اقترحت بشكل عام لكولينز أن عنصرًا رجعيًا مختلفًا، يسمى R2، يعمل بشكل أفضل لإدخال الجينات المحورة بشكل آمن.

نظرًا لعدم وجود R2 في البشر، اكتشف كولينز وكبير الباحثين شياوتشو تشانغ من جامعة كاليفورنيا في بيركلي وزميلة ما بعد الدكتوراه بريانا فان دريجك R2. نسخة تستهدف مناطق الحمض النووي الريبوزي (rDNA) في الجينوم البشري وتكون فعالة في إدخال مساحات طويلة من الحمض النووي في المنطقة.

وقال كولينز: “بعد مطاردة العشرات منها، جاء الفائزون الحقيقيون من الطيور”، بما في ذلك عصفور الحمار الوحشي والعصفور ذو الحلق الأبيض.

على الرغم من أن جينومات الثدييات تفتقر إلى R2، إلا أنها تحتوي على مواقع ربط مطلوبة لـ R2، وهي إشارة ربما إلى أن أسلاف الثدييات كان لديهم عنصر رجعي يشبه R2 تم طرده بطريقة ما. جينوم الثدييات.

في التجارب، قام تشانغ وفان دريجك بدمج بروتين R2 المشفر لـ mRNA ونموذج RNA لتشكيل جين محور مع بروتين فلوري يتم التعبير عنه بواسطة مروج بوليميريز RNA. وتم تحويلها إلى خلايا بشرية مزروعة. تتوهج نصف الخلايا باللون الأخضر أو ​​الأحمر بسبب تعبير البروتين الفلوري تحت ضوء الليزر، مما يدل على أن نظام R2 قد نجح في إدخال بروتين فلوري عامل في الجينوم.

وأظهرت دراسات أخرى أن الجينات المحورة تدخل فعليًا في مناطق الحمض النووي الريبوزي (rDNA) في الجينوم، وأنه يمكن إدخال حوالي 10 نسخ من قالب الحمض النووي الريبي (RNA) دون تعطيل وظيفة إنتاج البروتين لجينات الحمض النووي الريبوزي (rDNA).

مركز التخليق الحيوي الريبوسوم العملاق

يعد إدخال الجينات المحورة في مناطق الحمض النووي الريبوزي (rDNA) في الجينوم مفيدًا لأسباب أخرى غير توفير ملاذ آمن. تم العثور على مناطق الحمض النووي الريبوزي (rDNA) على الأذرع المسطحة لخمسة كروموسومات منفصلة. تتجمع كل هذه الأذرع العنيدة معًا لتشكل بنية تسمى النواة، حيث يتم تحويل الحمض النووي إلى RNA الريباسي، والذي ينضم إلى آلية الريبوسوم التي تصنع البروتينات.

داخل النواة، يتم تنظيم نسخ الحمض النووي الريبوزي (rDNA) بشكل كبير، وتخضع الجينات لإصلاح سريع لأن أي DNA المتاشب (rDNA) المكسور، الذي يُترك للانتشار، يمكن أن يوقف إنتاج البروتين. ونتيجة لذلك، سيتم التعامل مع أي جينات معدلة يتم إدخالها في منطقة الحمض النووي الريبوزي (rDNA) للجينوم باستخدام قفازات عدة داخل النواة.

وقال كولينز: “النوية عبارة عن مركز عملاق للتخليق الحيوي للريبوسوم”. “لكنها بيئة متخصصة جدًا في إصلاح الحمض النووي، مع انخفاض خطر الإصابة بالسرطان من إدخال الجينات. ومن الذكي أن هذه العناصر الرجعية الناجحة – وأنا أنسنها – قد دخلت إلى الحمض النووي الريباسي. إنها نسخ متعددة، ومحفوظة، وهي ملاذ آمن. يمكنك تعطيل إحدى هذه النسخ والخلية لا تهتم..”

وهذا يجعل المنطقة موقعًا مثاليًا لإدخال الجينات للعلاج الجيني البشري.

اعترف كولينز بأن الكثير لا يزال غير معروف حول كيفية عمل R2، ولا تزال هناك أسئلة حول بيولوجيا نسخ الحمض النووي الريبي النووي (rDNA): ما هو عدد جينات الحمض النووي الريبوزي (rDNA) التي يمكن تعطيلها قبل أن تلاحظ الخلية؟ نظرًا لأن بعض الخلايا تقوم بإيقاف تشغيل العديد من جينات الحمض النووي الريبوزي (rDNA) التي يزيد عددها عن 400 جين في الجينوم البشري، فهل هذه الخلايا أكثر عرضة للآثار الجانبية لـ PRINT؟

تقوم هي وفريقها بالتحقيق في هذه الأسئلة، لكن PRINT تعدل العديد من البروتينات وRNAs المشاركة في إدخال العنصر الرجعي لتعمل بشكل أفضل في الخلايا المستنبتة والخلايا الأولية من الأنسجة البشرية.

ومع ذلك، فإن خلاصة القول هي “أنها تعمل”، على حد قوله. “نحن بحاجة إلى فهم المزيد عن بيولوجيا الحمض النووي الريبوزي (rDNA) الخاص بنا للاستفادة منه حقًا.”